(495)604-44-44

Эксклюзивный дистрибьютор лабораторного оборудования

Teст-системы для определения микотоксинов фирмы Neogen

Анализаторы и оборудование для контроля качества пищевых продуктов

Микотоксины (от греч. цокд^, mykes, mukos — «гриб»; to^ikov, toxikon — «яд») — токсины, низкомолекулярные вторичные метаболиты, вырабатывемые микроскопическими плесневыми грибами

АФЛАТОКСИН ОХРАТОКСИН ДОН ЗЕАРАЛЕНОН Т-2 ФУМОНИЗИН
Где встречается Ячмень, свекловичныйжом, кокос, инжир, мамалыга, сорго, орехи, попкорн, семенатыквы, лебеда, рисовые отруби, рис, соевая крупка, пшеница, специи, подсолнечник, кукуруза, сухофрукты Пшеница, рис, рисовая мука, овес, кукуруза, ячмень, соевые бобы, соевый шрот, шрот подсолнечника, изюм, инжир, финики, абрикосы, зеленый кофе, жареные кофе-бобы, растворимый кофе, виноматериалы Ячмень, рожь, пшеница, овес,кукуруза, свекловичный жом, сено, силос, сорго, х/б изделия, готовые завтраки, макароны Ячмень, кукуруза, овес, пшеница, высушенная барда, х/б изделия, корм для домашних животных Зерновые, кукуруза, рис, соя, соевые бобы, соевый шрот, шрот подсолнечника, высушенная барда Кукуруза,кукурузная мука, сорго, соевый шрот, свекповичныйжом, высушенная барда, попкорн, корм для домашнихживотных, рис-сырец
Вредные воздействия Повреждение печени, низкая продуктивность, кровотечения, ослабление иммунной системы Повреждение печени, почек и мочевого пузыря, низкая продуктивность, ухудшение перевариваемое™ корма, ослабление иммунной системы, задержка роста, воспаления кишечника, возбуждение раковых клеток Тошнота, рвота, отказ от корма, гастроэнтерит, диарея,ослабление иммунной системы, заболевания крови,внутренние кровотечения, бесплодие Вульвовагинит, недоношенность, прерывание беременности, ненормальная течка, снижение размера помета, потеря либидо, замедление процесса размножения, выкидыши
Алиментарно-токсическая алейкия, снижение прироста веса, поражение клюва, слабое оперение, нарушение двигательных функций, гематологические и сердечные последствия Рак пищевода, разжижение мозга, отеклегких, поражение печени и поджелудочной железы,неврологические поражения, развитие раковых клеток
Группы риска
1 2 3 4 5 6

ДОН

Дезоксиниваленол (ДОН) - представитель семейства трихотхецинов, продуцируется чаще всего красной плесенью Fusarium graminearum, паразитирующей в зерновых, таких как пшеница, кукуруза и ячмень. ДОН вызывает следующие симптомы отравления: тошнота, рвота, отказ от корма, гастроэнтерит, диарея, подавление иммунитета и заболевания крови.
Свиньи проявляют высокую чувствительность к ДОНу. Они будут отказываться от корма, если содержание ДОНа более чем 1 ppm. Этот токсин и его аналоги вызывают токсические эффекты также и у других животных с различной степенью чувствительности. ДОН является причиной ухучшения качества произведенной пищи - посторонний привкус у готовых к употреблению злаков и неблагоприятное влияние на качество теста. Точное определение присутствия токсина имеет важное значение в определении качества корма и пищи.

ЗЕАРАЛЕНОН

image010

Зеараленон вырабатывается плесенью рода Fusarium graminearum, которая также продуцирует дезоксиниваленол. Поэтому, при обнаружении зеараленона можно предполагать наличие других микотоксинов рода Fusarium. Зеараленон классифицируется как эстрогенный микотоксин вследствие того, что он зачастую является причиной эстрогенных реакций у животных.
Потребление корма, зараженного зеараленоном, нарушает репродуктивную функцию животных. У поросят это может являться причиной вульвовагинита, недоношенности, прерывания беременности, снижения размера помета, ненормальной течки, потери либидо. Зеараленон способен замедлять процесс размножения и стоить производителям значительных экономических и физических потерь.
Животноводы во всем мире все больше узнают о проблемах, связанных с зеараленоном и борются с заражением корма. Лучшая защита от микотоксинов - это определение их присутствия в корме и пище. Это значит, что необходим контроль на всем пути технологического процесса, начиная с уборки урожая и заканчивая конечными продуктами.

ФУМОНИЗИН

image011

Открытый в 1989 году, фумонизин относится к семейству микотоксинов, продуцируемых плесенью рода Fusarium verticillioides. Она обычно поражает кукурузу (в ней фумонизин выявляется чаще всего). Поэтому вероятность найти его в корме и продуктах питания достаточно высока. Фумонизины воздей¬ствуют на разных животных по-разному, а у людей мо¬гут вызывать рак пищевода.
Агентство по защите окружающей среды США классифицировало фумонизины как канцерогены категории II-B. Лошади крайне чувствительны к небольшим количествам фумонизина, который может вызывать у них разжижение мозга. Как показывают исследования, у свиней фумонизин поражает сердечно-легочную систему, вызывая отек легких, а также поражение печени и поджелудочной железы.

АФЛАТОКСИН

image015

Афлатоксин считается наиболее сильным из известных канцерогенов, встречающихся в природе. Он вызывает множество различных заболеваний как у людей, так и у животных. Афлатоксин - это побочный продукт плесневения широкого спектра сырья и пищевых продуктов. Существует две грибковые культуры, которые являются основными продуцентами афлатоксина - Aspergillus flavus и A. para¬siticus. Эти грибки встречаются в любой точке мира. Они передаются через почву, но предпочитают расти на семенах, богатых питательны¬ми веществами. Токсины продуцируются во время уборки урожая на полях и после уборки при хранении. В обоих случаях грибковому поражению способствует порча продуктов насекомыми, неправиль¬ное обращение и воздействие внешней среды.
Когда зараженный афлатоксином корм попадает в пищу, это может вызвать множество проблем со здоровьем. Часто это может стать причиной низкой продуктивности у скота и птицы. Во многих случаях развиваются другие болезни, которые затем диагностируются
как причина низкой продуктивности. Из-за того, что афлатоксин не выявлен как первопричина, зараженный корм может продолжать поступать в пищу, вызывая при этом развитие болезней

ОХРАТОКСИН

image017

Охратоксин А продуцируется главным образом плесенью Aspergillus ochraceus и Penicillium viridicatum, которая встречается в кукурузе, ячмене, сорго, пшенице, сухофруктах и зеленом кофе. Охратоксин может присутствовать в сочетании с афлатоксином, одним из самых сильных канцерогенов, встречающихся в природе. Охратоксин воздействует на почки животных, подверженных влиянию этого микотоксина. В момент вспышки охратоксикоза у индейки и других птиц проявляется низкий уровень продуктивности. Симптомами являются задержка роста и снижение перевариваемое™ корма. Известно также, что охратоксикоз влияет на яйцекладкуу куриц-несушек.
Наилучшая защита от микотоксинов - это определение их присутствия в кормах и пище. Это означает, что необходим контроль на всем пути технологического процесса, начиная с уборки урожая и заканчивая конечными продуктами.

ТОКСИН Т-2

Токсин Т-2, который вырабатывается некоторыми разновидностями плесени Fusarium, является основным токсином, вызывающим у людей алиментарно-токсическую алейкию (недостаток лейкоци¬тов, возникающий в результате пищевого отравления). Он может также оказывать негативное воздействие на многих животных. Нарушение белкового синтеза - характерное проявление токсического действия Т-2. Исследования домашней птицы показывают, что интоксикация, вызванная токсином Т-2, приводит к снижению прироста веса и другим проблемам, таким, как поражение клюва, слабое оперение, нарушение двигательных функций и увеличение восприимчивости к Salmonella spp. У животных наблюдается нарушение кишечной перистальтики, рвота и измененная митохондриальная функция. Отравление токсином Т-2 сопровождается обширным повреждением тканей и органов и приводит к гематологическим и сердечным осложнениям. Повреждения пищеварительного тракта токсином Т-2 необратимы.
Потребители должны проверять зерно и кормовые товары на наличие в них токсинов. Кроме людей, токсин Т-2 поражает также свиней, молочный скот, домашнюю птицу, собак и лошадей. В наиболее тяжелых случаях токсин Т-2 является причиной смерти. Наилучшей защитой от микотокси¬нов является определение их присутствия в корме и пище. Это значит, что необходим контроль на всем пути технологического процесса, начиная с уборки урожая и заканчивая конечными продуктами

Тест-системы для количественного и качественного определения природных токсинов фирмы Neogen Corporation (США)

Средства для определения содержания микотоксинов от фирмы Neogen

7 Наборы Agri-Screen являются предварительным диагностирующим качественным тестом, который сравнивает до 5 образцов одновременно с образцами с заранее известным содержанием токсинов. Тест визуально дает понять, какой образец содержит боль¬ше или меньше токсина по сравнению с контрольным образцом.
8 Индикаторные наборы Reveal и Reveal SQ (полуколичественный) для капельного анализа содержания Афлатоксина и ДОН проявляют на индикаторе полоску при нанесении образца рядом с установленной границей. Если Reveal для афлатоксина выявляет менее, чем 20 ppb микотоксина в образце, то на тестовом индикаторе проявятся 2 полоски. В случае, если выявлено более чем 20 ppb, будет проявлена только одна полоска. Использование считывающего устройства AccuScan III совместно с наборами Reveal позволяет осуществлять полуколичественное определение микотоксинов, хранение и анализ результатов.
9 Наборы Veratox и Veratox ST (простой тест) для природных токсинов являются количественными микропланшетными тестами, которые сравнивают одновременно до 19 образцов с контрольными образцами (1 образец для ST). с помощью микропланшетного спектрофотометра результаты могут быть количественно выражены в частях на миллион (ppm) или вчастяхнамиллиард (ppb).
10 NeoColumn для афлатоксина, дезоксиниваленола, охратоксина А и зеараленона - это иммуноаффинные колонки, которые эффективно выделяют и концентриру¬ют токсины перед проведением анализов посредством высокоэффективной жидкостной хроматографии, флюорометрии или с помощью тестовых наборов Neogen Veratox.

Тест-система AGRI-SCREEN для качественного определения природных токсинов

image025

Наборы Agri-Screen (Рис.1) служат для предварительной качественной оценки содержания токсинов. Принцип оценки: сравнение образцов со стандартами с заранее известным содержанием токсинов. Тест визуально дает понять, какой образец содержит больше или меньше токсина по сравнению с контрольным образцом.
Наборы Agri-Screen предназначены для определения содержания афлатоксина, дезокси- ниваленола и фумонизина в сырье и пищевых продуктах.

Перед началом анализа необходимо провести экстракцию образцов.

1.    Добавить 100 мкл конъюгата в каждую лунку, помеченную красным цветом. image027
2.    Добавить 100 мкл контроля и образца в соответствующие лунки. Перемешать. image029
3.    Перенести по 100 мкл образца в лунки с антителами. Инкубировать при комнатной температуре. image031
4.    Слить жидкость из лунок. Тщательно промыть лунки дистиллированной водой и удалить оставшуюся воду с помощью фильтроваль¬ной бумаги. image033
5.    Добавить по 100 мкл субстрата в лунки. Инкубировать при комнатной температуре.
6.    Добавить по 100 мкл стоп-буфера в лунки.
7.    Визуально определить результат как:
•    отрицательный, если цвет пробы темнее, чем контроль;
•    положительный, если цвет пробы светлее, чем контроль.
image035

Тест-система AGRI-SCREEN для качественного и полуколичественного определения природных токсинов

Индикаторные наборы Reveal и Reveal SQ (полуколичественный) для капельного анализа содержания афлатоксина и ДОН проявляют на индикаторе полоску при нанесении образца рядом с установленной границей. Если Reveal для афлатоксина выявляет менее 20 ppb микотоксина в образце, то на тестовом индикаторе проявятся 2 полоски. В случае, если выявлено более 20 ppb, будет проявлена только одна полоска. Использование считывающего устройства AccuScan III совместно с наборами Reveal (Рис.2) позволяет осуществлять полуколичественное определение микотоксинов, хранение и анализ результатов.

image037

Рис. 2. Тестовый набор Reveal для определения афлатоксина и считыва¬ющее устройство AccuScan

Как работают тест-системы REVEAL

image040

Принцип действия тестовых индикато¬ров Reveal заключается в следующем (Рис. 3). На первом этапе часть экстрагированного вещества попадает на подушечку для образца. После этого образец пересекает участок с реагентом, который содержит специфические для искомого вещества (микотоксина) анти¬тела, соединенные с окрашенными части¬цами. В том случае, если искомое вещество присутствует в образце, оно будет связываться с антителами и окрашенными частицами.
Затем комплекс токсин-антитело- окрашенные частицы покидает участок с реагентом и проходит через мембрану тестового участка индикаторной полоски. Тестовый участок включает в себя участок искомого вещества с антителами антиискомо¬го вещества, задерживающими комплекс, и контрольный участок с цветной полоской.
Оставшаяся часть образца перемещает¬ся в конец мембраны, где осаждается в так называемый остаточный резервуар.
Контрольный участок также содержит иммунный комплекс, который извлекается из адсорбента с помощью растворенного образца, независимо от присутствия в нем искомого вещества. Контрольный конъюгат проходит через мембрану к контрольному участку, где отображает видимую цветную полоску. Независимо от присутствия или отсутствия искомого вещества, контрольная полоска будет отобра¬жена на контрольном участке, чтобы обеспечить возможность для сравнения с ней анализируемой пробы.

Процедура анализа содержания афлатоксина

1.    Взвесить    10 г измельченного образца    и добавить 20 мл 70%-ного раствора метанола (50 мл дистиллированной воды для ДОН). 11
2.    Интенсивно встряхивать или перемешивать в смесителе в течение 1 минуты. Дать образцу отстояться. 12
3.    Отфильтровать пробу через шприцевой фильтр Neogen или через воронкус фильтровальной бумагой. 13
4.    Добавить 200 мкл (300 мкл для ДОН) растворителя в пробирку для образца, а затем 200 мкл (100 мкл для ДОН) экстракта и перемешать 3 раза. 14
5.    Поместить индикаторную полоску Rveal в пробирку на 3 минуты (5 минут для ДОН), после чего интерпретиро¬вать результаты. 15

Интерпретация результатов REVEAL

image043

и/или

image045

Визуально результаты можно определить как:
•    наличие микотоксина - если на индикаторе отображены 2 полоски - контрольный и испытуемый образцы (за 1-2 минуты);
•    отсутствие микотоксина - если на индикаторе отображена только одна полоска контрольного образца (3 минуты).
Результаты можно также интерпретировать, используя считывающее устройство Асси- Scan, позволяющее определять содержание микотоксинов в диапазоне: 0-10 ppb, 10-20 ppb и более 20 ppb - для афлатоксина и 0¬0,5 ppm, 0,5-1 ppm, 1-2 ppm и более 2 ppm - для ДОН.
Для визуализации и хранения результатов, полученных с помощью считывающего устройства Асси- Scan, используется специальное программное обеспечение. 

Тест-система VERATOX для количественного определения природных токсинов

image047

Рис. 4. Тестовый набор Veratox ST для определения афлатоксина

Для количественного определения микотоксинов во многих продуктах используются специальные иммуно¬ферментные наборы Veratox (Рис.4). Удобные в использовании и интерпрета¬ции иммуноферментные методы, в основе которых лежит присоединение к антителам ферментной метки, позволяют учитывать результат реакции антиген¬антитело по выявлению ферментативной активности или по изменению ее уровня. Антитела от фирмы Neogen отличаются высокой чувствительностью, и их высокая эффективность подтверждена заказчика¬ми по всему миру.

Как работают тест-системы VERATOX

image049

Рис. 5. Изменение цвета субстрата в зависимости от концентрации микотоксинов

image051

Рис. 6. Спектрофотометр StatFax 321 для количественного определения содержания микотоксинов

image053

Рис. 7. Калибровочная кривая для количественного определения содержания микотоксинов

Каждый тест содержит связанное в планшетах (лунках) антитело, которое является специфическим для определяемого вещества. Исследуемый и контрольные образцы добавляют¬ся в соответствующие лунки. Далее добавляется ферментный конъюгат (исследуемое вещество, химически связанное с ферментом). Исследуемый и контрольные образцы вместе с конъю¬гатом перемешиваются и переносятся в лунки, где они конкурируют между собой за участки связывания антител. Чем больше определяемого вещества в образце, тем меньше конъюгата связывается в лунках. После инкубации для удаления несвязанных веществ лунки промываются. Субстрат, добавляемый в лунки, изменяет цвет в присутствии конъюгата. Во время инкубации окрашивание синим цветом происходит в соответствии с количеством конъюгата против определяемого вещества в лунках. Чем больше конъюгата свяжется, тем более синей становится окраска, указывающая на меньшее количество исследуемого вещества.    Выявление    результатов проводится визуально: чем меньше синего цвета и больше красного, тем больше в образце исследуемого вещества (Рис.5).
Тест является прямым иммуно¬ферментным (ELISA) методом, обеспе¬чивающим точное    определение
при содержании микотоксинов на уровне нескольких мкг/кг (ppb). Для количественного определения результаты, получающиеся измерением оптической плотности раствора на спектрофотометре (Рис.6), сравнивают со стандартной калибровочной кривой (Рис.7) и опреде¬ляют точную концентрацию токсина в испытуемом образце.

Механизм определения VERATOX

16 1.    Планшеты покрыты антителами, специфичными к исследуемому веществу.
2.    Конъюгат реагирует с исследуемым и/или контрольным образцами для связывания сучастками антител.
3.    Конъюгат и исследуемое и/или контрольное вещества остаются в связанном состоянии в планшете.iMsi
4.    Для изменения окраски добавляется субстрат.
5.    Результаты выявляются визуально или с помощью спектрофотометра - чем меньше синего цвета и больше красного, тем больше концентрация искомого вещества.

17

Перед началом анализа необходимо провести экстракцию образцов.

1.Добавить по 100 мкл коньюгата в лунки.  image069
2. Добавить по 100 мкл контрольных и исседуемых образцов.  image067
3. Перемешать. Перенести по 100 мкл в лунки с антителами. Инкубировать 5 минут. image073
4. Слить жидкость из лунок. image071
5. Промыть лунки дистиллированной водой и удалить оставшуюся воду с помощью фильтровальной бумаги. image077
6. Добавить по 100 мкл субстрата в лунки. Можно использовать 12-канальный дозатор. Инкубировать 5 минут. image075
7. Добавить по 100 мкл стоп-буфера в лунки. image079
8. Используя спектрофотометр, определить оптическую плотность при длине волны 650 нм и рассчитать концентрацию микотоксина. image081

Допустимое содержание микотоксинов согласно СанПиН*

Афлатоксин В1

мг/кг

Зерно, орехи, кофе, чай, какао

0,005

Пшеница, рожь, тритекале, овес, ячмень, просо, гречиха, рис, кукуруза, горох, фасоль, маш, чипа, нут, чечевица, крупа, толокно, хлопья

0,005

Мука пшеничная, ржаная, кукурузная, тритекалевая, ячменная, пшенная, рисовая, сорговая,гречневая

0,005

Крахмалы, макаронные изделия, продукты детского питания на зерновой основе

0,00015

Изоляты, концентраты, гидролизаты и текстураты растительных белков; пищевой шрот и мука с различным содержанием жира из семян бобовых, масличных и нетрадиционных культур

0,005

Охратоксин А

мг/кг

Пшеница, рожь, овес, ячмень, рис

0,005

Крупа, толокно, хлопья (пшеничные, ржаные, ячменные, овсяные, рисовые)

0,005

Мука пшеничная, ржаная, рисовая, ячменная, овсяная

0,005

Продукты детского питания на зерновой основе

0,0005

Зеараленон

мг/кг

Пшеница, кукуруза, ячмень

1,0

Крупа, толокно, хлопья (пшеничные, ячменные, кукурузные)

0,2

Мука пшеничная, кукурузная, ячменная

0,2

Крахмалы, макаронные изделия, продукты детского питания на зерновой основе

0,005

ДОН

мг/кг

Пшеница, рожь, тритекале, овес, просо, гречиха, рис, кукуруза, пшеничная крупа, толокно, хлопья

0,7

Ячмень, ячменная крупа, толокно, хлопья, мука ячменная

1,0

Мука пшеничная, ржаная, кукурузная, тритекалевая, пшенная, рисовая, сорговая, гречневая

0,7

Крахмалы, макаронные изделия, продукты детского питания на зерновой основе

0,05

Фумонизин

мг/кг

Продукты детского питания (для кукурузной муки)

0,2

Т-2 токсин

мг/кг

Пшеница, рожь, тритекале, овес, просо, гречиха, рис, кукуруза, ячмень, ячменная крупа,толокно,хлопья

0,1

Пшеничная крупа, толокно, хлопья

0,7

Мука пшеничная, ржаная, кукурузная, тритекалевая, пшенная, рисовая, сорговая, гречневая, ячменная

0,1

Крахмалы, макаронные изделия, продукты детского питания на зерновой основе

0,05

  • - Регламентировано:
    • СанПиН 2.3.2.1078-01 Гигиенические требования безопасности и пищевой ценности пищевых продуктов;
    • СанПиН 2.3.2.1280-03 «Дополнения и изменения N 2 кСанПиН 2.3.2.1078-01»;
    • СанПиН 2.3.2.2401-08 «Дополнения и изменения N 10 кСанПиН 2.3.2.1078-01»;

Оборудование и материалы, необходимыедля анализов

18